荧光定量PCR 第一期 | 常见名词解释
做荧光定量 PCR（qPCR）时，总被 Ct 值、基线、熔解曲线、内参基因这些名词绕晕？扩增曲线看得懂，术语解释却一知半解？
今天整理了 qPCR 实验中最常用的核心名词，新手也能快速入门。
一、基础核心概念
♦ 荧光定量 PCR（qPCR）
全称实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time Quantitative PCR），指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的实时累积，监测整个 PCR 进程，最终通过标准曲线或内参基因对起始模板进行定量分析的技术。
区别于普通 PCR，qPCR 可以 "实时" 看到扩增过程，定量更精准、灵敏度更高。
♦ RT-qPCR
即逆转录—荧光定量 PCR（Reverse Transcription qPCR）。先将样本中的 RNA 逆转录为 cDNA，再以 cDNA 为模板进行 qPCR 扩增。常用于检测基因的 mRNA 表达水平，是分子生物学最常用的基因表达分析手段。
♦ 模板（Template）
PCR 扩增的起始核酸样本，可以是 DNA（基因组 DNA、质粒 DNA）或逆转录后的 cDNA。模板的纯度、完整性和初始浓度，是决定 qPCR 结果成败的核心因素。
♦ 引物（Primer）
一段与模板 DNA 互补的短单链寡核苷酸，长度通常为 18-25 bp，是 DNA 聚合酶启动合成的 “起点”。qPCR 对引物特异性要求极高，非特异性扩增会直接干扰定量结果。
二、荧光化学体系类名词
♦ 荧光染料法（SYBR Green I）
图1：嵌合染料法作用机制示意图
最常用的非特异性荧光化学体系。SYBR Green I 是一种能与双链 DNA（dsDNA）结合的荧光染料，游离状态下几乎无荧光，结合到双链 DNA 上后荧光信号大幅增强。
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优点：成本低、无需设计探针、通用性强；
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缺点：会与所有双链 DNA 结合，引物二聚体、非特异性产物都会产生荧光信号，需配合溶解曲线验证特异性。
图2：TaqMan®探针标记法作用机制示意图
特异性荧光定量体系。探针是一段与靶序列互补的寡核苷酸，5' 端标记荧光基团，3' 端标记淬灭基团。探针完整时，荧光基团发出的光被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq 酶的 5'-3' 外切酶活性将探针切断，荧光基团与淬灭基团分离，释放荧光信号。
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优点：特异性极强、可进行多重检测；
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缺点：成本高、需针对每个靶点单独设计探针。
♦ 荧光基团 / 淬灭基团
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荧光基团：能吸收特定波长激发光、并发射出另一波长荧光的分子，常见的有 FAM、VIC、HEX、ROX 等。
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淬灭基团：能吸收荧光基团能量、抑制荧光发射的分子，常见的有 BHQ1、BHQ2、TAMRA 等。
♦ ROX 校正染料
一种被动参比荧光染料，不参与 PCR 反应，荧光强度恒定。用于校正孔与孔之间的体积误差、加样偏差和仪器光路差异，提升数据重复性，是 ABI 系列仪器的标配校正体系。
为了方便产品选择，愚公生物推出通用染料的荧光定量PCR产品Taq SYBR® Green qPCR Premix (Universal)抗体热启动染料法荧光定量PCR预混液（通用ROX），适用于任何机型。
三、扩增曲线与核心指标
图3：扩增曲线示意图
♦ 扩增曲线（Amplification Curve）
qPCR 反应过程中，以循环数为横坐标、荧光信号强度为纵坐标绘制的曲线，呈典型的 “S 型”。完整的扩增曲线分为三个阶段：基线期、指数扩增期、平台期。
♦ 基线（Baseline）
PCR 反应初期，荧光信号背景噪声阶段，此时扩增产物量极少，荧光信号与背景无明显差异。仪器会通过计算基线期的平均荧光值，确定背景水平，后续所有荧光信号均需扣除基线值。
♦ 阈值（Threshold）
人为设定的一条荧光信号水平线，通常设置在指数扩增期的中部，也就是荧光信号显著高于背景噪声、且扩增呈对数增长的区域。阈值线与扩增曲线的交点，对应的值就是 Ct 值。
♦ Ct 值（Cycle Threshold）
又称循环阈值，指荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。
核心规律：起始模板量越高，达到阈值所需的循环数越少，Ct 值越小；起始模板量越低，Ct 值越大。Ct 值与起始模板量的对数呈线性负相关，是 qPCR 定量的核心依据。
♦ 扩增效率（Amplification Efficiency）
衡量 PCR 扩增是否理想的指标，理想状态下每个循环产物翻倍，扩增效率为 100%。实际实验中，90%-110% 的扩增效率均视为可接受范围，扩增效率偏离过大，定量结果会出现严重偏差。
扩增效率通常通过标准曲线计算，公式为：
E = (10−1/斜率 − 1) × 100%
四、熔解曲线与产物分析
♦ 熔解曲线（Melting Curve）
SYBR Green 法的必备验证实验。PCR 扩增结束后，逐步升高温度，双链 DNA 逐渐解链变为单链，SYBR Green 染料随之解离，荧光信号逐渐下降。以温度为横坐标、荧光信号变化速率（-dF/dT）为纵坐标绘制的曲线，就是熔解曲线。一般来说，特异性目的产物的峰值范围在80℃ ~ 90℃之间，呈现单一峰。
♦ Tm 值（解链温度）
双链 DNA 解链 50% 时对应的温度，是核酸的固有属性，与片段长度、GC 含量相关。
结果判断：特异性良好的产物，熔解曲线呈现单一尖锐峰；若出现多个峰，说明存在非特异性扩增、引物二聚体或基因组 DNA 污染。
♦ 引物二聚体（Primer Dimer）
图5：体系存在引物二聚体示意图
引物之间因互补配对形成的非特异性双链产物，是 SYBR Green 法最常见的干扰因素。引物二聚体的 Tm 值通常低于目的产物，在溶解曲线上表现为低温区的杂峰，会导致 Ct 值偏小、定量结果失真。
五、定量方法与内参相关
♦ 绝对定量
通过已知浓度的标准品绘制标准曲线，将待测样本的 Ct 值代入曲线，计算出样本中靶基因的绝对拷贝数。
♦ 相对定量
最常用的定量方法，不关心基因的绝对拷贝数，只比较不同样本间靶基因的表达差异（如处理组 vs 对照组）。通常以内参基因作为校正标准，最终结果以 “倍数变化” 表示。
♦ 内参基因 / 管家基因
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管家基因（Housekeeping Gene）：在各种细胞、组织中稳定表达，表达量受环境影响极小的基因，如 GAPDH、β-actin、18S rRNA 等。
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内参基因：实验中选作校正基准的管家基因，用于消除样本量、RNA 提取效率、逆转录效率差异带来的误差，是相对定量的核心校正依据。
♦ 2-ΔΔCt 法
相对定量最经典的计算方法，由 Livak 提出。通过两次 ΔCt 计算：
ΔCt = 目的基因 Ct − 内参基因 Ct
ΔΔCt = 处理组 ΔCt − 对照组 ΔCt
最终以 2-ΔΔCt 表示基因表达的倍数变化。
该方法默认目的基因与内参基因的扩增效率均接近 100%，是目前科研文献中最通用的相对定量算法。
六、常见质控名词
♦ 无模板对照（NTC）
反应体系中不加模板，只加入引物、酶、水等试剂的对照孔。用于检测试剂、耗材、环境中是否存在核酸污染，正常情况下 NTC 孔无扩增曲线、Ct 值为 Undetermined。
♦ 无逆转录对照（NRT）
RNA 样本不经过逆转录步骤，直接作为模板进行 qPCR 的对照。用于检测样本中是否存在基因组 DNA 污染，若 NRT 孔出现扩增，说明 RNA 样本有 gDNA 残留。
♦ 复孔
同一样本、同一体系同时做 2-3 个平行反应孔，用于验证实验重复性，减少加样误差。复孔 Ct 值偏差通常应小于 0.5 个循环，偏差过大说明实验操作或体系存在问题。
注意：
1、复孔 Ct 值偏差 > 0.5 个循环时，说明实验操作或体系存在问题，需排查原因。
2、复孔不等于技术重复。
写在最后
荧光定量 PCR 是分子生物学的基础工具，看似简单，实则每一个名词背后都对应着实验原理与质控逻辑。搞懂这些核心术语，不仅能看懂实验报告，更能快速定位实验异常、优化反应体系。
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