没有具体的稀释参考倍数，一般cDNA每稀释2倍Ct值变大1，可以根据这个规律进行合适的稀释。可以使用cDNA原液、10倍稀释液作为模板进行定量实验，根据规律选择Ct值落在18~28范围内的稀释倍数。也可以参考换试剂之前的稀释倍数。
注：当使用cDNA原液进行检测的时候，使用量不能超过qPCR反应体系的1/10，因为cDNA中包含很多抑制qPCR的组分，cDNA体积大时风险很高。

二代：
1）RNase H活性：无
2）最长产物长度：9 kb
3）最适反应温度：42℃
4）cDNA产率：☆
5）抗二级结构：☆
6）逆转录速度：☆
7）抑制剂耐受能力：☆
三代：
1）RNase H活性：无
2）最长产物长度：12 kb
3）最适反应温度：50℃
4）cDNA产率：☆☆
5）抗二级结构：☆☆
6）逆转录速度：☆☆
7）抑制剂耐受能力：☆☆
四代：
1）RNase H活性：无
2）最长产物长度：20 kb
3）最适反应温度：55℃
4）cDNA产率：☆☆☆
5）抗二级结构：☆☆☆
6）逆转录速度：☆☆☆
7）抑制剂耐受能力：☆☆☆
三代TDT活性最强，适合做建库；四代扩增速度最快，适合做IVD和基因表达研究；二代最便宜

可能原因：
1. 模板中存在抑制剂
2. 引物扩增效率低
解决办法：
1. 稀释模板，或者重新制备模板
2. 提高引物浓度，或者尝试三步法扩增程序，或者重新设计引物

可能原因：cDNA模板加入量过多
解决办法：按说明书推荐量加入，或者稀释cDNA样本

可能原因：基线设置不当
解决办法：建议减小基线终点（例如基线默认3~15循环，可改为3~10个循环），重新分析数据

可能原因：
1. 探针或者染料有降解；
2. 仪器长时间未校准或者过度使用，荧光收集不稳定；
3. 八联排管子或PCR板子与机型不匹配；
4. 反应管内有气泡。
解决办法：
1. 更换新探针或新试剂；
2. 定期进行仪器校准及维护保养；
3. 建议挑选合适的耗材用于实验；
4. 加样完成后轻弹离心去除气泡或者延长预变性时间至10 min，以去除气泡。

可能原因
1. 加样误差，移液不准确
2. 模板量低
3. 仪器长时间未校准或者过度使用，荧光收集不稳定
4. 反应管内有气泡
解决办法
1. 移液器定期校准或者提前配制好反应预混液
2. 提高模板量
3. 定期进行仪器校准及维护保养
4. 加样完成后轻弹离心去除气泡或者延长预变性时间至10 min，以去除气泡

可能原因：
ROX浓度和机型不匹配。
解决办法：
将仪器上的参比染料设置由ROX更改为NONE，取消ROX的校正功能，查看扩增曲线是否恢复正常。

可能原因：
1.模板量低或基因表达丰度低
2.引物扩增效率低
3.引物可能降解或使用不对或与模板不匹配
4.模板中存在抑制剂
解决办法：
1.建议增加模板量观察Ct值能否成相应倍数减少
2.提高引物浓度，或者尝试三步法扩增程序，或者重新设计引物
3.更换新引物或者重新设计引物
4.稀释模板，或者重新制备模板

可能原因：
1.荧光信号采集步骤未设置或者设置错误；
2.引物可能降解或使用不对或与模板不匹配；
3.模板浓度过低；
4.模板隆解。
解决办法:
1.两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火&延伸阶段，三步法扩增程序应当将信号采集设置在 72℃延伸阶段；
2.更换新引物或者重新设计引物；
3.减少模板稀释倍数重复实验，样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起；
4.重新制备模板，重复实验。