某些限制酶对同一底物的不同位点切割效率不同，这种现象被称为位点优势效应(Site Preferences)。
例如 NarI，它表现出明显的位点偏好性，在 pBR322 上 548 bp 位置的 NarI 位点处，酶切十分缓慢。

切割超螺旋所需酶量一般比切割线性 DNA 要多。通常在标准反应体系中切割超螺旋 DNA 所需的酶量是切割 λDNA 的 3~5 倍。

同裂酶（isoschizomer）：识别相同核苷酸序列的限制酶互为同裂酶，例如：BsmBI 与 Esp3I 均识别 CGTCTCNNNNN。对同裂酶的定义有两种观点：一种观点认为识别相同序列且在相同位置切割的酶才能称为同裂酶；另一种认为只要识别相同序列即为同裂酶，该观点认为下文提及的异裂酶也是同裂酶的一部分。同裂酶之间反应温度、反应缓冲液、甲基化敏感性、星号活性等可能不同，不能简单替换。

• 底物中无所选限制酶的酶切位点，可能是由于序列突变或其他因素导致。
• 很多限制酶对于 DNA 的甲基化非常敏感，应确保 DNA 的甲基化类型不会阻止限制酶反应。
• 某些质粒提取试剂盒提取的底物带有杂质，会抑制酶切反应。
• 部分酶需要 2 个及以上的识别位点才能进行切割，如 SfiI。

原因（1）载体自连。
解决方法：载体去磷酸化不彻底。通过对去磷酸化的载体连接和转化来验证。使用碱性磷酸酶对载体进行去磷酸化处理。
原因（2）仍存在未被酶切的载体。
解决方法：通过转化酶切后尚未进行连接的载体来验证。对酶切后的载体进行凝胶回收后再用于连接。
原因（3）插入片段对细胞有毒性。
解决方法：1. 尝试在较低温度（30℃或室温）培养细菌。克隆出现将需要更长时间。
2. 尝试使用不同菌种。
原因（4）使用的抗生素浓度过低。
解决方法：使用正确浓度的抗生素。
原因（5）抗生素发生降解。
解决方法：使用无抗性的感受态细胞进行平板涂布，以确认抗生素筛选是正常工作的。

大多数实验人员遵循的一般原则是10 U的限制性内切酶足以克服DNA来源、数量和纯度的不确定性。通常是在50 μl体系，适合的 1×反应缓冲液中，1 μg纯化的 DNA 中加入1 μl酶，，然后在推荐温度下孵育1小时。如果使用了过量的酶，为了省时，通常可以缩短孵育时长。
为了保证反应体系中甘油浓度低于5%，以 50% 甘油形式提供的限制性内切酶不应超过总反应体积的 10%。
一个成功的限制酶消化的一个极其重要但经常被忽视的因素是混合。反应必须充分混合才能实现完全消化。建议轻柔地上下吹打反应混合物或轻弹管壁。然后在微量离心机中瞬离。切勿涡旋，更多体系和限制酶反应的具体信息，请参阅对应每个限制酶的产品说明书。

等温扩增反应可以非常快速和稳定，但经常会出现非特异性扩增。这就可能表现为假阳性，必须加以控制以实现可靠的扩增结果。对于LAMP等方法的引物设计和优化通常是提高特异性的最有效方法，但也可以优化其他反应参数。例如，反应温度可以用来提高反应效率和特异性；使用 Bst II DNA Polymerase (Large Fragment) 的的最佳反应温度是65°C，但可以在50–66°C 的范围内进行优化。

Touchdown PCR是一种提高PCR反应特异性的方法。它使用一种循环程序，其中退火温度逐渐降低（例如 1-2°C /每次循环）。初始退火温度应比引物的Tm值高。然后逐渐降低退火温度，直到达到引物的理论退火温度或低于几度。然后使用该退火温度继续扩增。

Bst II DNA Polymerase (Large Fragment) 截短去除了 Bacillus stearothermophilus DNA 聚合酶的 5'→3' 核酸外切酶结构域，具有很强的 5'→3' DNA 聚合酶活性和链置换活性，最适反应温度为 65℃，适用于多种等温扩增反应，如环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP)、滚环扩增(Rolling Circle Amplification, RCA)、解旋酶依赖性扩增(Helicase-Dependent Amplification, HDA) 等。相比野生型，Bst II DNA Polymerase (Large Fragment) 具有更快的扩增速率、更强的 dUTP 耐受性和耐盐性、以及更好的稳定性。

RNA质量从两个方面评价：
(1) RNA完整度。通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整度。以真核生物为例，完整的总RNA有清晰的三条带，分子量从大到小分别为28S、18S、5S，并且28S是18S亮度的两倍；若能看见三条带，但带型模糊或弥散，则说明RNA有部分降解，此时请立即进行逆转录反应，并适量加大模板量；若只能看见分子量很小的一条带或没有条带，则 RNA 已完全降解，需要重新提取。
(2) RNA的纯度。RNA的纯度可以通过OD260/280和OD260/230两个比值是否在1.8-2.1范围内进行判断，蛋白、离子等残留会使比值降低。