Split-GFP 衍生 FAST 检测技术：无细胞蛋白表达定量新方案
无细胞蛋白合成（CFPS）作为体外蛋白制备、翻译机制解析、靶向药物高通量筛选的核心技术平台，已广泛应用于毒性蛋白、难溶性重组蛋白与基因元件功能验证领域。传统蛋白定量检测方法存在放射性污染、操作流程冗长、通量受限、干扰目标蛋白结构等多重缺陷，制约 CFPS 体系规模化应用。本文系统介绍经工程化改造的 Split-GFP 检测体系 ——FAST（Fluorescent Assembly of Split-GFP for Translation Tests），该体系依托改良荧光片段实现液相荧光定量，且可同步完成目标蛋白亲和纯化，为无细胞表达样本检测提供标准化解决方案。
一、传统无细胞蛋白检测技术存在核心局限
当前主流蛋白表征手段的应用短板显著：
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放射性氨基酸标记：检测灵敏度高，但存在辐射安全风险，放射性废弃物处置成本高，实验室合规管控要求严苛；
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免疫印迹、凝胶显色分析：包含制胶、电泳、转膜、抗体孵育多步操作，单批次实验周期长，难以适配高通量样本筛选；
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全长荧光蛋白融合标记：报告基因片段长度大，消耗体外翻译体系有限能量与底物，易改变目标蛋白折叠特性，干扰蛋白天然活性。
二、Split-GFP 荧光互补基础原理
Split-GFP 技术将完整绿色荧光蛋白拆分为两段无荧光活性独立多肽片段：大片段 GFP1-10、微型标签 GFP11。两类片段单独存在时无荧光信号；当 GFP11 与目标蛋白融合表达后，与 GFP1-10 片段共孵育可自发组装重构完整 GFP空间结构，形成功能性荧光发色团。体系荧光信号强度与融合蛋白摩尔浓度呈线性相关，可实现蛋白精准定量。
Split-GFP 荧光互补用于目的蛋白含量检测
三、FAST 检测体系完整工作流程
1.载体构建
目的基因通过柔性多肽 linker 与 GFP11 标签框内融合，GFP11 片段序列短，对目的蛋白翻译效率与空间构象干扰极低；
2.体外转录翻译
体系适配实验室自制大肠杆菌 S30 粗提物、商用 PURExpress 纯重组无细胞试剂盒，完成目标融合蛋白体外合成；
3.荧光互补反应
CFPS 反应结束后，体系中加入纯化 MBP:GFP1-10fast，25℃恒温孵育 2–4 h；孵育 2–2.5 h 可达到 70%–80% 稳定荧光信号，4 h 荧光信号完全达到平台期；
4.样本分析与回收
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定量检测：多功能酶标仪检测 520 nm 荧光强度，依据标准曲线换算目标蛋白摩尔浓度；最低检出限可达 8±2 pmol 多肽；
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亲和纯化：利用 MBP 与麦芽糖树脂特异性结合，通过标准亲和层析捕获荧光复合物，完成目标蛋白回收，蛋白回收率约 50%。
FAST系统用于体外蛋白质合成的荧光监测
四、FAST 体系相较传统检测方案核心优势
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生物安全：完全规避放射性标记，无危废处理需求，降低实验室运营与合规成本；
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高通量液相检测：无需电泳、转膜等固相分离操作，兼容 96/384 微孔板并行检测，大幅压缩批量样本分析周期；
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低干扰标记：GFP11 标签分子量极小，对目标蛋白表达量、折叠与生物活性影响微弱；
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一体化实验流程：独有 MBP 融合设计，荧光定量完成后可直接开展亲和纯化，无需额外构建纯化载体；
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体系兼容性：可匹配自制粗提无细胞体系、商品化重组 CFPS 试剂盒两类主流体外表达平台。
结语
FAST 工程化 Split-GFP 检测体系针对性解决传统无细胞蛋白检测的多重痛点，整合安全、高效、高通量、可同步纯化多重优势，可为合成生物学、体外蛋白制备、药物筛选领域提供标准化检测工具。
参考文献
[1] Pham T D, Poletti C, Tientcheu T M N, et al. FAST, a method based on split-GFP for the detection in solution of proteins synthesized in cell-free expression systems[J]. Scientific Reports, 2024, 14(1): 8042. https://doi.org/10.1038/s41598-024-58588-5.
[2] Lévrier A, Capin J, Mayonove P, et al. Split Reporters Facilitate Monitoring of Gene Expression and Peptide Production in Linear Cell-Free Transcription–Translation Systems[J]. ACS Synthetic Biology, 2024, 13(9): 3119-3127. https://doi.org/10.1021/acssynbio.4c00353.
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